Es el encargado de eliminar la materia orgánica biodegradable aún presente. Consiste en estimular artificialmente la multiplicación de microorganismos capaces de asimilar la materia orgánica transformándola en masa celular insoluble, fácilmente separable. También se conoce como "tratamiento biológico" u "oxidación biológica" y no es otra cosa que la aplicación de los mecanismos naturales de autodepuración, en condiciones controladas.
Los organismos que pueden desarrollarse durante el tratamiento biológico se encuentran en las propias aguas residuales. Los microorganismos más sencillos, las bacterias, pueden metabolizar la mayoría de los compuestos orgánicos. También pueden hacerlo los hongos pluricelulares. Las algas verdes utilizan la luz solar como fuente de energía y producen oxígeno, que favorece a las bacterias y a los hongos. Los organismos superiores (protozoos, rotíferos), tienen que alimentarse de los organismos inferiores, por lo que su presencia es un indicador de que el agua está suficientemente depurada.
El tratamiento secundario puede llevarse a cabo por diferentes procesos, cuya elección dependerá de razones tecnológicas y de imperativos económicos.
Las balsas de estabilización, se construyen en el terreno con profundidades de hasta 2 m. Para lograr buenas reducciones de DBO se requieren grandes extensiones de terreno, ya que la fuente de oxígeno la aportan las algas.
Las lagunas aireadas son similares a las balsas, pero en ellas el oxígeno se suministra mediante aireadores mecánicos superficiales. Ésto aumenta el rendimiento y reduce la superficie necesaria hasta 15 veces.
Los filtros percoladores son lechos de piedras o de materiales plásticos dispuestos en tanques circulares de gran diámetro y unos 10 m de profundidad. El agua residual se pulveriza sobre el lecho y se deja drenar a través de él, recogiéndose en su parte inferior. La materia orgánica se degrada gracias a una población microbiana que se va formando sobre el medio filtrante como un limo.
El proceso de lodos activos consiste en airear vigorosamente el agua residual en un tanque, lo que hace aumentar la población microbiana, que se deposita en forma de lodo en un sedimentador anexo que permite su separación. Este lodo ("activo", por su elevada concentración en microorganismos) se recicla en buena parte al tanque de aireación y el resto se purga con destino al tratamiento de lodos.